基于CRISPR开发的非病毒精准 T 细胞受体细胞疗法

任何癌症治疗的最终目标都是靶向并杀死癌细胞，同时保留正常细胞。人类免疫系统T细胞受体TCR 对癌症细胞突变的特异性识别可以实现这一目标。癌症基因的突变改变了癌细胞表面主要组织相容性复合体 (MHC) 呈递的肽的氨基酸序列，而TCR靶向胞内靶点的受体可以区分癌症基因组中的单点突变[1]。突变新抗原为过继细胞转移 (ACT) 疗法的活性提供了主要靶标。之前的人类 T 细胞工程依赖于使用重组病毒载体，但为每位患者生成多个个性化临床级载体是不可行的。由于CRISPR-Cas9的精确基因编辑技术的出现[2]，无需使用病毒载体也可实现稳定整合的基因表达。研究人员开发出新的转基因靶向，使得T细胞具有重新定向到新突变抗原的能力。

最近Susan P. Foy[3]等人开发了一种基于 CRISPR-Cas9 、非病毒载体、能精确编辑基因组的临床级治疗方法，主要是通过该方法同时敲除两个内源性 TCR 基因TRAC（编码 TCRα）和TRBC（编码 TCRβ），还插入了从患者的循环 T 细胞中分离出的新抗原特异性 TCR (neoTCR) 的两条链。研究人员描述了一种能够有效分离突变新抗原特异的多个 TCR 的方法如图1。该策略使用由个体患者的 HLA I 类等位基因呈现的数百个预测的新抗原肽序列的个性化文库和靶向的非病毒基因编辑方法，来重建分离的 neoTCR 的特异性。总的来说，这个省时的过程能够产生用于ACT的临床级neoTCR 转基因 T 细胞制剂。

研究人员从患者来源的PBMCs建立好的T细胞库文库提取出识别新突变抗原的TCR序列，接下来自每个捕获的 T 细胞的TRAC和TRBC基因被单细胞测序并克隆到同源重组 (HR) DNA 质粒中。这些 HR 质粒与位点特异性核酸酶一起用于敲除内源性 TCRβ 链，并将转基因TRAC和TRBC基因插入 CD8 和 CD4 T 细胞的内源性TRAC位点（如图2所示）。然后测试每个neoTCR候选物以识别同源新抗原或错配的新抗原对照，以确认新抗原肽-HLA 特异性结合和干扰素-γ (IFNγ) 细胞因子分泌。重组的 neoTCR 与可溶性肽-HLA 复合物的结合实验表明，在 127 个测试的 TCR 中，有 73 个 (57%) 是特异性且功能足够的 neoTCR，可用于临床治疗选择。临床前概念验证的数据则表明，使用我们的方法分离出的 neoTCR，然后将其改造到原代 T 细胞中，能够特异性识别和杀死表达内源性新抗原水平的肿瘤细胞。

经过一系列筛选及构建，接下来研究人员将 neoTCR 改造的 T 细胞输注到患者体内，实验结果发现所有患者都经历了 3-4 级全血细胞减少症，这是由于淋巴细胞耗竭预处理方案导致的预期毒性。但有两起毒性事件可能归因于 neoTCR 转基因 T 细胞疗法。一共11 名患者出现疾病进展PD，其中5 名患者在首次肿瘤评估（输注后第 28 天）出现PD。其中两名患者的一些目标病变的大小有所减小。这包括临床试验中的第一位患者，即剂量水平 1 组的 0010，其在第 28 天的目标病灶最大直径总和缩小了 17%。总之，这篇研究证明了使用基于 CRISPR 的基因敲除和基因敲入编辑将 T 细胞基因重定向到人类突变新抗原的能力，为实体瘤癌患者提供广泛适用的、肿瘤特异性的、个性化的 T 细胞疗法。用 neoTCR 替代内源性 TCR 会导致 T 细胞仅对特定 HLA 呈递的突变作出反应，从而为 T 细胞工程改造和重定向至癌细胞提供安全靶点。通过对这种方法的可行性和安全性的证明，neoTCR 改造的 T 细胞可以进一步进行基因改造以增加其功能。

Ref：

[1]. van Rooij N, et al. Tumor exome analysis reveals neoantigen-specific T-cell reactivity in an ipilimumab-responsive melanoma. J. Clin. Oncol. 2013;31:e439–e442. doi: 10.1200/JCO.2012.47.7521.

[2]. Eyquem J, et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 2017;543:113–117. doi: 10.1038/nature21405.

[3]. Foy SP, Jacoby K, Bota DA, Hunter T, Pan Z, Stawiski E, Ma Y, Lu W, Peng S, Wang CL, Yuen B, Dalmas O, Heeringa K, Sennino B, Conroy A, Bethune MT, Mende I, White W, Kukreja M, Gunturu S, Humphrey E, Hussaini A, An D, Litterman AJ, Quach BB, Ng AHC, Lu Y, Smith C, Campbell KM, Anaya D, Skrdlant L, Huang EY, Mendoza V, Mathur J, Dengler L, Purandare B, Moot R, Yi MC, Funke R, Sibley A, Stallings-Schmitt T, Oh DY, Chmielowski B, Abedi M, Yuan Y, Sosman JA, Lee SM, Schoenfeld AJ, Baltimore D, Heath JR, Franzusoff A, Ribas A, Rao AV, Mandl SJ. Non-viral precision T cell receptor replacement for personalized cell therapy. Nature. 2023 Mar;615(7953):687-696. doi: 10.1038/s41586-022-05531-1. Epub 2022 Nov 10. PMID: 36356599; PMCID: PMC9768791.