山东大学毕双玉等利用单细胞FRET揭示细菌代谢网络的动态波动过程及调控机制

中央代谢通路的进行过程通常被认为是具有确定性的，但细胞是处于动态平衡中的自催化和随机系统。因此，代谢网络的性质及其与基因转录表达和其它细胞过程的相互作用本质上是随机的，这可能导致网络活动的动态波动。这些波动可能会对生物网络可靠地执行其功能产生影响，但也可能会导致群体中细胞之间的有益变化。动态波动既可以在基因转录水平产生，又可能在翻译后水平产生。

尽管微生物中基因转录随机性的起源和结果已经被广泛研究，但翻译后水平产生的随机波动的过程和重要性仍然是未知的。另外，尽管生物代谢网络与生物体各项生命活动息息相关，但由于检测手段的敏感性低以及欠缺可操作性等原因，在单细胞层次实时、定量检测胞内代谢产物的浓度变化一直难以实现，尤其是在微小的细菌细胞中。然而，基于荧光读数的生物传感器的开发，例如荧光能量共振转移（FRET）技术，实现了对活细胞代谢过程的定量监测。

2023年4月15日，山东大学微生物技术国家重点实验室毕双玉教授与德国马克斯普朗克陆地微生物研究所 Victor Sourjik 教授合作，在 Nature Communications 期刊发表了题为：Dynamic fluctuations in a bacterial metabolic network 的研究论文。

该项研究基于荧光能量共振转移（FRET）技术搭建了可以在单细胞水平实时监测细菌胞内代谢产物浓度的显微镜成像系统，使用荧光蛋白标记的FRET传感器，跟踪单个大肠杆菌细胞中关键代谢产物丙酮酸在时间分辨尺度下的浓度变化动力学。

研究团队通过计算机模拟和实验证明，当饥饿的大肠杆菌细胞暴露于葡萄糖或其它几种糖酵解碳源时，单个细胞中丙酮酸的胞内水平在大约100秒的时间尺度上表现出大的周期性波动，这些代谢波动取决于丙酮酸转化所涉及的生物化学反应，并且糖酵解的动态波动会传递到其它细胞过程，导致群体内细胞状态的时空异质性。

研究团队首先构建了一个由4种代谢物和6个代谢反应组成的简化的代谢动力学模型。将糖酵解通量固定为一个恒定值，并对所有模型参数，包括最大速率和结合常数随机采样使模型处于稳态，再通过改变葡萄糖摄取速率来扰动这个稳态，并分析这种扰动是否会导致糖酵解通路终产物丙酮酸浓度的振荡波动。模型预测显示，大肠杆菌糖酵解通路可以在几分钟的时间尺度上产生代谢物的周期振荡波动，并且在很大的参数范围内都可以产生这种振荡。

接下来，研究团队使用FRET显微镜成像系统及丙酮酸传感器，通过实时监测FRET信号捕捉大肠杆菌群体以及单细胞内丙酮酸水平的动态变化过程。表达了该传感器的大肠杆菌可以对外界丙酮酸、葡萄糖以及其它糖酵解碳源的添加做出响应，在数秒内观察到胞内丙酮酸水平的增加。更有趣的是，当添加微摩尔浓度的葡萄糖时，大多数单细胞内的丙酮酸水平在碳源初始刺激后的1000秒以上，表现出持续且强烈的振荡波动，时间尺度是几分钟。这种持续的振荡只在低浓度葡萄糖（10-100 μM）刺激下有所体现。单细胞FRET比值的功率谱密度（PSD）分析显示，当大肠杆菌细胞暴露于高浓度葡萄糖时，在整个频率范围内没有显著的波动，而对于暴露于低浓度葡萄糖的细胞，在低频率下的PSD明显高于背景噪声，这与其FRET比值在几分钟时间尺度上的大幅振荡波动一致，并通过自相关性分析显示出明显的振荡周期性。

利用单细胞FRET技术测定大肠杆菌胞内丙酮酸水平的动态波动

另外，当受到果糖刺激时，大肠杆菌单细胞的丙酮酸振荡仅略弱于葡萄糖诱导的振荡；甘油醛-3-磷酸能够引起较弱的波动，而2-磷酸甘油酸仅能引起微弱的低频波动；当添加磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸以及醋酸时都不会产生波动。作者进一步研究了丙酮酸振荡对糖酵解途径中相关酶的依赖性，发现pykF缺失可以显著增加单个细胞中FRET信号的周期性振荡。而当pykA、 ppc单独或共同与pykF敲除时极大降低了丙酮酸的振荡。此外，丙酮酸的振荡波动可由于丙酮酸脱氢酶复合体组分之一aceF的缺失而消失。因此，丙酮酸振荡取决于丙酮酸转化所涉及的多个生物化学反应，这与计算模型相符。

研究团队还研究了大肠杆菌丙酮酸振荡波动与其它细胞过程的相关性。利用EIIA-CFP/MglA-YFP的FRET荧光蛋白，通过追踪单细胞FRET的变化，发现葡萄糖刺激下单细胞内磷酸转移系统（PTS）的磷酸转移反应也产生了动态波动，且频率范围与丙酮酸波动相似。另外，通过测量自发荧光分析大肠杆菌胞内NAD(P)H的波动显示，添加葡萄糖可快速增加胞内NAD(P)H水平，并且单细胞的NAD(P)H也产生了动态波动，其频率范围与丙酮酸波动相似。因此，丙酮酸振荡至少部分与PTS蛋白磷酸化状态及NAD(P)H的波动相耦合。

综上所述，由于代谢最终驱动所有的细胞过程，代谢途径的波动和不稳定性可以对细胞生理产生影响。在葡萄糖等碳源的刺激下，大肠杆菌单细胞丙酮酸水平在几分钟的时间尺度上表现出很大的振荡波动。这个时间尺度比基因转录表达短得多，因此观察到的振荡波动来自于代谢网络翻译后水平的动态变化。而丙酮酸转化过程中的酶和生化反应是振荡波动的主要来源。另外，考虑到糖酵解中间代谢物的多种调节功能，包括与丙酮酸波动相耦合的NAD(P)H和PTS，丙酮酸振荡可能对细菌生理产生深远的影响。

山东大学微生物技术国家重点实验室毕双玉教授为论文第一作者，德国马克斯普朗克陆地微生物研究所Victor Sourjik教授为通讯作者，德国图宾根大学Hannes links教授也参与了该项研究。